ראשי > כללי > רוץ בן סוסי רוץ ודהר בג'ל! – ללמוד פיזיקה במעבדת הביולוגיה (2)

רוץ בן סוסי רוץ ודהר בג'ל! – ללמוד פיזיקה במעבדת הביולוגיה (2)

ברשימה קודמת סיפרתי על הצנטריפוגה כדוגמה לפיזיקה פשוטה אך מעניינת שניתן ללמוד במעבדת הביולוגיה. הצנטריפוגה משמשת להפרדת חומרים מומסים במים. הרעיון הכללי הוא שהחיכוך בין מולקולות שונות לבין המים גורם להבדלים בקצב שיקוע שלהן והתנועה המעגלית בצנטריפוגה מייצרת 'כוח כבידה' חלופי חזק שמגביר את קצב השיקוע של החומרים.

הפעם אציג שיטה נוספת להפרדת חומרים, בעיקר מולקולות אורגניות גדולות כמו DNA וחלבונים, שאותה ניתן למצוא בכל מעבדה שעוסקת בביולוגיה מולקולרית בשימוש יום-יומי. אני אנסה גם לשכנע שלמרות שהמכשיר נראה מאוד שונה מצנטריפוגה הרעיון הבסיסי דומה.

***

נניח שיש בידינו מבחנה מלאה בחלקי DNA. כעת או שעלינו לבדוק האם אלה החתיכות הנכונות או שברצוננו להפריד חתיכות מסוג מסוים משאר החתיכות. כיצד נבצע זאת?

השיטה הפשוטה שבה נעשה שימוש בכל מעבדה נקראת אלקטרופורזה. ברשימה זאת אני אתמקד באלקטרופורזה של DNA.

אם נחזור להשוואה לצנטריפוגה, את שדה הכבידה המוגבר יחליף שדה חשמלי ואת החיכוך עם הנוזל יחליף ג'ל שישמש כמסלול מכשולים עבור המולקולות וייצור הבדל בתנועה שלהן. למעשה, בעבר היו מפרידים חתיכות DNA באמצעות צנטריפוגה בשיטה של גרדיאנט ריכוזים, אבל הדיוק שמתקבל באלטרופורזה הוא גבוה יותר והשיטה נוחה יותר.

***

הרעיון הוא לגרום לחתיכות ה-DNA לעבור דרך חתיכת ג'ל ששקועה בתוך נוזל יוני. ככל שחתיכת ה-DNA ארוכה יותר כך קצב התנועה שלה בג'ל נמוך יותר.

הג'ל עשוי מאבקה שמופקת מאצות וכאשר היא מומסת במים החתיכות נקשרות ומייצרות מין רשת שלוכדת בתוכה את המים ומייצרת גוש מוצק ורך. מכיוון שהג'ל ברובו נוזלי חתיכות ה-DNA יוכלו לעבור דרכו אך הרשת הפנימית תפריע לתנועתן. את הג'ל נניח בבריכה קטנה מלאה בנוזל יוני (בעגה המקצועית: running buffer). את חתיכות ה-DNA נטעין על גבי הג'ל בתוך שורת חריצים, מוכנים לזינוק (ראו תמונה 1).

Gel_electrophoresis_apparatus
תמונה 1: מכשיר לביצוע אלקטרופורזה. את הג'ל מניחים במיכל הפלסטיק וממלאים אותו בנוזל יוני. ניתן לראות את חוטי החשמל מחוברים מהמקור למיכל בשני קצותיו. המקור לתמונה: ויקיפדיה, לשם הועלתה על ידי המשתמש Jeffrey M. Vinocur.

חתיכות ה-DNA הם שרשראות באורכים שונים והן גם מכילות מטען חשמלי שלילי. דמיינו את החתיכות כסוסוני-ים שעומדים על קו הזינוק (בתוך החריצים בג'ל) לפני המרוץ. לכל סוסון יש זנב באורך שונה, מקצתם קצרים ומקצתם ארוכים ומשתרכים. ברגע שנפעיל מתח חשמלי בין שני קצוות הג'ל, הסוסונים יתחילו לרוץ לכיוון האלקטרודה שנמצאת במתח חשמלי חיובי שאותה הצבנו בצד הרחוק. ככל שזנב הסוסון ארוך יותר, כך הוא מתקשה במעבר בין רשת המכשולים בתוך הג'ל. כתוצאה, בזמן נתון סוסונים קצרים יעברו מרחק גדול יותר בג'ל מסוסונים ארוכים. יש לדאוג שלא להפעיל את המתח לזמן רב מידי כי אז יצאו הסוסונים מהצד השני של הג'ל ויברחו.

מולקולות ה-DNA הן שקופות ולא נוכל לדעת היכן הם נמצאות לאחר שנעו מהחריצים. לכן, לאחר שהנחנו את חתיכות ה-DNA בחריצים ולפני שהפעלנו את המתח החשמלי נוסיף חומר צביעה. בד"כ נעשה שימוש בחומר שנקרא אתידיום-ברומיד. כאשר מאירים אתידיום-ברומיד באור UV הוא פולט בתהליך פלואורסנטי אור בצבע כתום בוהק (ראו תמונה 2). עוצמת ההארה חזקה אף יותר כאשר הוא קשור למולקולות DNA.

AgarosegelUV
תמונה 2: ג'ל לאחר הרצה תחת אור UV. האתידיום-ברומיד מאיר בכתום. המקור לתמונה: ויקיפדיה, לשם הועלתה על ידי המשתמש TransControl.

בסוף ההרצה נוכל לצלם, תחת אור UV, את המיקום שאליו הגיעו חתיכות ה-DNA שהיו בחריצים.

"אוקיי, הבנתי איך המכשיר עובד אבל כיצד נוכל לדעת מה אורכן של הפיסות והאם הן אלו שרצינו?"

הפתרון כל כך פשוט שהוא גאוני.

בחריץ צדדי אנחנו נשים 'סולם' מוכן שקנינו בחנות. הכוונה היא לתמיסה שמכילה פיסות DNA מדודות וידועות באורכים שונים. בסיום הריצה נקבל לאורך המסלול של הסולם פסי הארה שונים, אחד עבור כל אורך שהכיל הסולם, מארוך לקצר. את האורכים אנחנו הרי יודעים ולכן כל פס מהווה כעת שלב ידוע בסולם. נוכל להשוות את המרחק שעברה הפיסה שאנחנו רוצים לבדוק למקבילה שלה בסולם ולקבוע מה אורכה (ראו תמונה 3).

DNAgel
תמונה 3: השוואה בין 3 סוגי חתיכות שונות של DNA (שלושת הטורים השמאליים). הטור הימני הוא הסולם. החריצים שמהם התחיל המרוץ נמצאים בחלק העליון של התמונה וכיוון התנועה הוא כלפי החלק התחתון. המקור לתמונה: ויקיפדיה, לשם הועלתה על ידי המשתמש Dr d12.

על ידי קביעת אורכם של פיסות ה-DNA נוכל לוודא שבידנו הפיסות שרצינו. כמו כן, אם היו לנו בתמיסה חתיכות באורכים שונים נוכל לחתוך מהג'ל את החתיכה שמכילה את הפס שמתאים לאורך הנכון לפי הסולם, ובכך להפריד אותה משאר החתיכות. מחתיכת הג'ל נוכל להפיק את ה-DNA הלכוד בו.

אם כך, האלקטרופורזה משמשת גם לבדיקת האורך של פיסות DNA וגם להפרדה של פיסות באורכים שונים אחת מהשניה.

מודעות פרסומת
  1. רענן דונוביץ
    26/01/2017 ב- 3:30 pm

    תודה
    האם אתה יכול להסביר מדוע כשמריצים DNA בגדלים של סדרה חשבונית, הסידור של "סולם הגדלים אינו לינארי?,
    אודה אם תוכל לידע על פרסום התשובה או לקבל תשובה בדוא"ל

    • 27/01/2017 ב- 12:45 am

      שלום רענן,
      למיטב ידיעתי, התלות של מהירות התנועה של חתיכות ה-DNA בג'ל תחת שדה חשמלי תלוי ביחס הפוך למסה המולקולרית. אם כך, ככל שפיסה גדולה יותר כך המהירות קטנה יותר והמרחק שתעבור קטן יותר. כלומר הקשר בין המהירות למסה נתון על ידי: v(m)=k*1/m, כאשר v מהירות, m מסה ו-k קבוע כלשהו.
      הסיבה לתלות הזאת אינה ברורה לחלוטין ויש מספר מודלים משוערים שאינני בקיא מספיק כדי לדון בהם.

  2. רענן דונוביץ
    27/01/2017 ב- 7:54 am

    תודה

  1. No trackbacks yet.

להשאיר תגובה

הזינו את פרטיכם בטופס, או לחצו על אחד מהאייקונים כדי להשתמש בחשבון קיים:

הלוגו של WordPress.com

אתה מגיב באמצעות חשבון WordPress.com שלך. לצאת מהמערכת / לשנות )

תמונת Twitter

אתה מגיב באמצעות חשבון Twitter שלך. לצאת מהמערכת / לשנות )

תמונת Facebook

אתה מגיב באמצעות חשבון Facebook שלך. לצאת מהמערכת / לשנות )

תמונת גוגל פלוס

אתה מגיב באמצעות חשבון Google+ שלך. לצאת מהמערכת / לשנות )

מתחבר ל-%s

%d בלוגרים אהבו את זה: