ראשי > כללי > תמיד ישנה פִּרְצָה: על גבול הדיפרקציה וסופר-רזולוציה

תמיד ישנה פִּרְצָה: על גבול הדיפרקציה וסופר-רזולוציה

גבול הדיפרקציה

ארנסט קרל אַבֶּה (Abbe, 1840-1905) היה פיזיקאי גרמני ואחד התורמים העיקריים להנחת היסודות של האופטיקה המודרנית. ביחד עם קרל צייס (Zeiss) הוא היה הבעלים של חברת האופטיקה המפורסמת Carl Zeiss AG שייצרה מיקרוסקופים וטלסקופים, ופועלת בהצלחה עד היום.

אחת מהתרומות המפורסמות ביותר של אבה היא הנוסחא המתארת את גבול הדיפרקציה או במילים אחרות הרזולוציה הטובה ביותר האפשרית עבור מיקרוסקופ, שאותה פרסם ב-1873. לפי נוסחא זאת גודל הפרטים הקטנים ביותר שנוכל להבחין בהם בעזרת המיקרוסקופ תלויים באורך הגל, בזווית איסוף האור לעדשה ובחומר שממנו נאסף האור (ראו תמונה 1). לשם פשטות, ניתן לקרב גודל זה לחצי מערכו של אורך הגל. אורך הגל של אור כחול עמוק הוא כ-450 ננומטר (ננומטר=10-9 מטר), מכאן שלא ניתן להבחין בעצמים הקטנים מ- 200-250 ננומטר. עבור חלק מהאברונים בתוך התא, חלק מהוירוסים ועבור חלבונים בודדים זה לא מספיק. האם אבד הכלח על מיקרוסקופית האור?

במילה אחת: לא. בשתי מילים: ממש לא. אם ההיסטוריה של המדע מלמדת אותנו משהו, זה שמישהו תמיד ימצא פרצה. גבול הדיפרקציה שריר ותקף גם היום, אך במשך השנים נמצאו דרכים רבות לעקוף אותו.

תמונה 1: אנדרטה לזכרו של אבה. במרכז הכדור המוזר ניתן לראות (ליחצו על התמונה כדי להגדיל) את הנוסחא המפורסמת של גבול הדיפרקציה עבור מיקרוסקופ: d=λ/2nsinθ, כאשר d הוא הגודל המינימלי הניתן להפרדה, λ אורך הגל, n מקדם השבירה ו-θ חצי-זווית איסוף האור לעדשה. המקור לתמונה: ויקיפדיה, לשם הועלתה ע"י המשתמש KaurJmeb.

כמה הערות לפני שנמשיך

כאשר אור עובר דרך סדק הוא עובר תהליך שנקרא דיפרקציה. הכוונה היא שאם נשים מסך אל מול הסדק במרחק מספיק גדול (תלוי במימדי המערכת) נקבל תבנית הארה מיוחדת על המסך. ישר מול הסדק יהיה כתם אור גדול כפי שהיינו מצפים, אך בצדדים יהיו עוד כתמים הולכים וקטנים בעוצמתם, שמהווים את תבנית הדיפרקציה (ראו איור 2). הכתם המרכזי מול הסדק יהיה רחב יותר מהסדק עצמו, כלומר ממקור האור. מכאן, שאלומת אור שעוברת דיפרקציה עוברת גם הרחבה או 'מריחה'. תופעה זאת מתרחשת גם במערכת המיקרוסקופ, וגבול הרזולוציה של אבה נובע מההשלכות שלה. 'המריחה' קיימת אפילו עבור מקור אור נקודתי, והיא מאפיין חשוב של מערכת מיקרוסקופ. בעגה המקצועית 'מריחה' של מקור אור נקודתי נקראת psf (קיצור ל- point spread function).


איור 2: תבנית דיפרקציה של אור העובר דרך סדק בודד. המקור לתמונה: ויקיפדיה, לשם הועלה ע"י המשתמש Magnus Manske.

ניתן לשפר את הרזולוציה של המיקרוסקופ גם מבלי לעקוף את מגבלות הדיפרקציה. שימוש באור באורכי גל קצרים יותר שאינם בתחום האור הנראה כגון UV וקרני X יקטין את כתם האור וישפר את הרזולוציה. הבעיה העיקרית, מלבד המחיר והקושי התפעולי, היא שאורכי הגל הקצרים הם בעלי אנרגיה גבוהה, וגורמים נזק לעצמים בהם הם פוגעים, במיוחד אם הם ביולוגיים. עיקר השימוש באופטיקה באורכי גל אלה הוא בתעשיית המוליכים למחצה.

המיקרוסקופיה הפלואורסנטית היא טכניקה שימושית מאוד עבור מחקר במדעי-החיים. בשיטה זאת נעשה שימוש בחומרים מיוחדים, שבהם אור באורך גל מסוים נבלע, עובר אינטראקציה עם האלקטרונים בחומר, ולאחר זמן מה נפלט מהם אור באורך גל ארוך יותר. לדוגמא, בחומרים מסוימים בליעה של אור באורך גל צהוב תגרור פליטה של אור באורך גל אדום. כיום יש לנו את היכולת לקשור לכל דבר ביולוגי, למשל לאברונים או חלבונים בתא, מולקולות פלואורסנטיות, ואז לצלם אותן בעזרת המיקרוסקופ (ראו תמונה 3). ניתן אפילו לגרום לתא לייצר בעצמו חלבונים פלואורסנטיים, ולעקוב אחרי תהליכים דינאמיים בתא חי.

תמונה 3: תאים תחת מיקרוסקופ פלואורסנטי. בתמונה: השלד התאי בתאים אאוקריוטיים. בירוק צבועים המיקרוטובולים, באדום מיקרופילמנטים (שבדיעבד מסמנים גם את ממברנת התא) ובכחול גרעיני התאים. המקור לתמונה: ויקיפדיה.

סופר-רזולוציה

נגדיר סופר-רזולוציה בצורה לא פורמלית כיכולת 'לראות' במיקרוסקופ עצמים הקטנים מגבול הדיפרקציה (לדוגמא קטנים מ-200 ננומטר) ולהפריד ביניהם.

נתחיל במקרה הפשוט ביותר. נניח שיש לנו עצם פלואורסנטי בודד בגודל כמה ננומטרים שאותו אנחנו רוצים לבחון בעזרת המיקרוסקופ. העצם קטן מגבול הדיפרקציה, ואם יאיר מספיק חזק יראה על המסך ככתם ברוחב כמה מאות ננומטרים לפחות (תלוי ב-psf). אך לא הכל אבוד, נוכל למצוא את המרכז של הכתם המרוח בעזרת התאמה לפונקציה מתמטית. על ידי פעולה זאת נוכל 'לתקן' את התמונה ולמצוא את מיקומו ואולי אף גודלו האמיתי של העצם.

תהליך תיקון זה של 'המריחה' מאפשר לנו 'לראות' בדיעבד עצמים בגודל כמה ננומטרים, הרבה מתחת לגבול הדיפרקציה. הבעיה היא שבדגם ביולוגי אמיתי עצמים פלואורסנטיים רבים (למשל חלבונים בתא) נמצאים קרוב מאוד אחד לשני. 'המריחות' שלהם עולות אחת על השניה ולא מאפשרות להפריד ביניהן בעזרת תהליך התיקון שתואר.

אחת השיטות להתגבר על בעיית ההפרדה ולקבל סופר-רזולוציה נקראת STORM (קיצור ל- Stochastic Optical Reconstruction Microscopy). הרעיון הוא לגרום לכך שרק מספר קטן מהעצמים הפלואורסנטיים מאיר ברגע נתון, כך שהמריחות שלהם לא עולות אחת על השניה. השיטה עושה שימוש בצביעה בעזרת מולקולות פלואורסנטיות מיוחדות אותן מאירים בלייזר בעוצמה חלשה. כתוצאה, המולקולות פולטות אור בצורה אקראית לזמנים קצרים, ואז הן כבויות לזמן ארוך. כעת ניתן לצלם רצף ארוך של תמונות, שבכל אחת מהן רק חלק קטן מהנקודות מאירות בצורה המרוחה הרגילה שאותה אנחנו יודעים לתקן. בסוף התהליך נחבר את כל התמונות המתוקנות לקבלת תמונה אחת בסופר-רזולוציה (ראו איור 4).

(אני ממליץ להיכנס לאתר של ממציאת השיטה מאוניברסיטת הרוורד, שביקרה באוניברסיטת תל-אביב לפני כשנתיים לקבלת פרס, כדי לראות תמונות באמת באמת מטריפות. אני לא מראה אותן כאן מפאת זכויות יוצרים.)


איור 4: תהליך ה-STORM. מרובע שחור מסמל נקודה מקורית, עיגול שחור נקודה לאחר תיקון, עיגול כחול מסמל את 'המריחה' כלומר מה שנראה בפועל במיקרוסקופ. את שלוש הנקודות במסגרת האדומה העליונה נראה ככתם גדול ללא תיקון. בעזרת השיטה נוכל להפריד בין הנקודות במיקרוסקופ.

ולפני פיזור

חשוב להדגיש שה-STORM היא רק אסטרטגיה אחת אפשרית לקבלת סופר-רזולוציה. בין השיטות האחרות ניתן למנות את ה-STED, ה-NSOM ואחרות.

ומה היה אומר אבה על כל המשחק הזה לו היה עדיין עימנו? אין לדעת כמובן, אבל אני בוחר לדמיין שהוא היה מצטרף לחגיגה עם כמה רעיונות מקוריים משלו כיצד לעקוף את אותו חוק דרקוני שקרוי על שמו.

מודעות פרסומת
  1. דניאל ר
    18/11/2012 ב- 9:22 pm

    חזק מאוד. חברתי משתמשת בטכניקה הזו אבל לא ידעתי שהיא כל כך מעניינת (הטכניקה, לא החברה).
    למיקרוסקופיה פלואורסצנטית יש יתרון כללי גדול: כיוון שאורך הגל שאתה מודד איננו אורך הגל שאתה משדר, אין בעיה של "רעש רקע".

  2. 18/11/2012 ב- 10:11 pm

    תודה 🙂
    בעקרון אתה צודק לגבי היתרון ברעש הרקע של מיקרוסקופיה פלואורסנטית. אני רק אדייק ואכתוב שיש *פחות* בעיה של רעשי רקע. במיקרוסקופיה פלואורסנטית רגילה יש בעיה של איסוף אור ממישורים רבים בדגם. זה היתרון במיקרוסקופיה קונפוקלית שאוספת אור רק ממישור בודד (לא הזכרתי את זה כאן כדי לא להעמיס יותר מידי בבת אחת). אבל גם במיקרוסקופיה קונפוקלית יש רעשי רקע בגלל שחומרים שונים ומשונים סביב הדגם עלולים להיות מעט פלואורסנטיים, ולפגוע ביחס אות לרעש.

  3. 19/11/2012 ב- 5:45 pm

    הסבר מעולה!
    אני עכשיו לומד את התחום של מיקרוסקופיה פלואורסנטית, ולמרות שנתקלתי בSTORM פה ושם עוד לא ממש התעמקתי בשיטות הללו.
    אגב, כדי לעזור לי בלימוד התחום, התחלתי בלוג משלי על מיקרוסקופיה פלואורסנטית (באנגלית. קישור דרך היוזר שלי ב-WP).
    מי שמתעניין מוזמן לבוא לקרוא ולהשתתף. אני אשמח ללמוד ממי שכבר בקיא יותר ממני.

  4. 19/11/2012 ב- 9:57 pm

    תודה, תודה 🙂
    אבקר בבלוג, זה נראה מעניין (למעשה כבר ערכתי בו ביקור קצר בעבר). כמה ידע מוקדם במדעי החיים נדרש לדעתך?

    • 20/11/2012 ב- 6:29 am

      דרוש ידע מוקדם. זה לא בלוג למי שאין לו מושג במדעי החיים. בוא נגיד שדרושה לפחות היכרות בסיסית עם חלבונים, גנים, מנגנוני בקרה בתא, אברונים וכדומה.
      כאמור, הבלוג נועד בראש ובראשונה לעזור לי לעשות סדר, ללמוד מושגים בסיסיים במיקרוסקופיה, להבין את הכלים והשיטות וכדומה. אגב, זה באמת עובד. כשאני מארגן מחשבות לרשומה, אני בהחלט מגלה שאני גם לומד יותר טוב.
      וזה גם נותן לי תירוץ לנתח מאמרים מדי פעם, קצת לקרוא יותר לעומק…. (גיליתי שככל שאני מתקדם יותר באקדמיה, וכביכול אמור לדעת יותר, כך יש לי פחות זמן לקרוא את כל המאמרים המעניינים, אפילו בתחום הצר שלי, שלא לדבר על תחומים נושקים או בכלל).

  5. 23/02/2014 ב- 9:49 pm

    שים לב שSTORM רלוונטי רק עבור מולקולות לא אורגניות, כלומר ניתן להסתכל רק על הצדדים החיצוניים של התא במידה ואתה לא רוצה להרוג אותו (וברוב המקרים תצטרך להרוג אותו). במידה ואתה רוצה להסתכל על דברים בתוך הממברנה/התא ואם אתה רוצה להסתכל על תא חי, אתה צריך להשתמש בPALM. אגב, יש מלא מלא רעש רקע ברוב המדידות שתעשה, תודה לאמא אדמה שיש אלגוריתמים חזקים שמתגברים עליו.

  6. 23/02/2014 ב- 10:02 pm

    פזי: תודה על ההרחבה. אני נזכר שבמחקר אותו ראיתי מקרוב ונעשה בו שימוש ב-STORM המטרה היתה לאתר חלבונים ממברנליים, ואם אני לא טועה, התאים לא היו חיים.

  1. 23/08/2013 ב- 2:49 pm

להשאיר תגובה

הזינו את פרטיכם בטופס, או לחצו על אחד מהאייקונים כדי להשתמש בחשבון קיים:

הלוגו של WordPress.com

אתה מגיב באמצעות חשבון WordPress.com שלך. לצאת מהמערכת / לשנות )

תמונת Twitter

אתה מגיב באמצעות חשבון Twitter שלך. לצאת מהמערכת / לשנות )

תמונת Facebook

אתה מגיב באמצעות חשבון Facebook שלך. לצאת מהמערכת / לשנות )

תמונת גוגל פלוס

אתה מגיב באמצעות חשבון Google+ שלך. לצאת מהמערכת / לשנות )

מתחבר ל-%s

%d בלוגרים אהבו את זה: